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干貨分享~卡巴氧、喹乙醇及代謝物前處理方法

點擊次數：5419 更新時間2021-04-19 【關閉】

喹噁啉類藥物的危害及檢測目的

喹噁啉類藥物是一類化學合成類的抗菌促生長劑，它們的基本結構是喹噁啉-1,4-二氧化物，即喹噁啉環。主要包括喹乙醇、卡巴氧、喹喔啉、喹賽多、喹多辛、西諾喹多、德那資多（肼多司）、乙酰甲喹和喹烯酮等藥物。研究表明，喹噁啉類藥物對DNA致突變、致損傷，破壞細胞抗氧化作用系統，可以引起細胞自由基的產生，導致細胞DNA發生氧化性損傷，還會引起細胞周期阻滯和細胞凋亡。傳統喹噁啉類藥物喹乙醇和卡巴氧，由于其對人體危害最大，世界各國和國際組織對這兩種獸藥制定了嚴格的殘留*規定。歐盟1998年發文禁止喹乙醇和卡巴氧在食品動物生產中作為促生長添加劑使用。2020年我國生效實施的GB 31650-2019《食品安全/國家標準食品中獸藥最大殘留*》中規定了豬肌肉和豬肝臟組織中喹乙醇殘留標志物的最大殘留*。同年我國農業農村部公告第250號規定卡巴氧及其鹽、酯為食品動物中禁止使用的藥品。但是，這些藥物在生產實踐中被大量地非法使用或濫用，其殘留對消費者健康造成了巨大的潛在威脅。喹乙醇和卡巴氧進入動物體內后，能夠在短時間內代謝成十多種產物，研究表明，3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是喹乙醇在動物體內代謝后的主要產物，喹噁啉-2-羧酸（QCA）是卡巴氧在動物體內代謝后的主要產物，且該產物在動物體內滯留時間較長，因其含量與總殘留關系穩定，所以將MQCA定為喹乙醇在動物體內代謝的殘留標示物，將QCA定為卡巴氧在動物體內代謝的殘留標示物。

本文闡述了如何將卡巴氧、喹乙醇及代謝物從樣品基質中分離提取出來，并經過凈化后，轉化成液質聯用儀可以檢測的形式。以提取、凈化為重點，依據國標GB/T 20746-2006，為檢測人員和相關領域研究人員提供一定的參考。

檢測項目：卡巴氧、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸（QCA）、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）

應用范圍：牛、豬肝臟和肌肉

液相色譜-串聯質譜法

方法原理：

卡巴氧：用乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液提取肌肉和肝臟組織中的卡巴氧，提取液經正己烷脫脂后，旋轉蒸發至干，殘渣用甲酸（0.1 %）+甲醇（19+1）溶液溶解。樣液供液質測定，內標法定量。

脫氧卡巴氧、QCA、MQCA：用甲酸溶液消化試樣，使組織中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，鹽酸酸化，離心過濾后，過Oasis MAX固相萃取柱或相當者凈化。先用二氯甲烷洗脫脫氧卡巴氧，再用2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脫QCA和MQCA，氮氣吹干洗脫液，殘渣用甲酸+甲醇（19+1）溶液溶解，樣液供液質測定，內標法定量。

前處理儀器：固相萃取裝置；氮氣濃縮儀；液體混勻器；分析天平（感量0.1 mg和0.01 g）；真空泵；均質器；移液器（10 μL～100 μL和100 μL～1000 μL）；聚丙烯離心管（50 mL具塞）；pH計（測量精度±0.02 pH單位）；低溫離心機（可制冷到4 ℃）；玻璃離心管（15 mL）。

檢測儀器：HPLC-MS/MS+ESI源

試樣制備與保存

將牛、豬肝臟和肌肉組織樣品充分攪碎，均質，分出0.5 kg作為試樣，置于清潔樣品容器中，密封，并做上標記。將制備好的試樣于-18 ℃以下保存。

前處理方法

1. 卡巴氧的前處理步驟

稱取5 g試樣（精/確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 g中性氧化鋁，加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，于液體混勻器上充分混合5 min，以5000 r/min離心5 min，將上清液移取至另一干凈的50 mL離心管，加入10 mL正己烷到管中，振蕩2 min，以5000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，將下層清液轉移至150 mL雞心瓶中。加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，重復提取一次，正己烷除脂后合并兩次提取液于同一雞心瓶中，加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d₄（QCA-d₄）標準溶液，使其濃度為2.0 ng/g，40 ℃水浴減壓旋轉蒸發至干。準確加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（19+1）溶液溶解殘渣，過0.2 μm濾膜后，供液質測定。

2. 脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的前處理步驟

稱取5 g試樣（精/確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.6 %甲酸溶液，混勻后，置于（47±3）℃振蕩水浴中振搖1 h；先加入3 mL1.0 mol/L Tris溶液混勻，再加入0.3 mL 0.01 g/mL蛋白酶水溶液，充分混勻后，置于（47±3）℃振蕩水浴中酶解16 h～18 h。加入20 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液，振蕩5 min，在10 ℃以5000 r/min離心15 min，上清液過濾。將濾液移入Oasis MAX固相萃取柱（3 mL甲醇和3 mL水活化）中，待樣液全部流出后，用30 mL 0.05 mol/L乙酸鈉-甲醇（19+1）溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干15 min。在一支干凈的玻璃管內加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d₄（QCA-d₄）標準溶液，使其濃度為2.0 ng/g，再用4×3 mL二氯甲烷將脫氧卡巴氧洗脫至管內，在45 ℃用氮氣濃縮儀吹干。固相萃取柱再用3×3 mL甲醇、3 mL水、3×3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液和2×3 mL甲醇-水（1+4）溶液分別淋洗，真空抽干15 min，然后用2 mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，棄去全部淋出液，最后用3 mL 2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脫喹噁啉-2-羧酸（QCA）和3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）到上述吹干的試管中，在45 ℃用氮氣濃縮儀吹干。準確加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（19+1）溶液溶解殘渣，過0.2 μm濾膜后，供液質測定。